Иммуноблотинг

Здравоохранение материалы / Экспресс диагностика особо опасных инфекций / Экспресс-диагностика чумы / Иммуноблотинг

Иммуноблоттинг — разновидность гетерогенного иммун­ного анализа. Сущность его заключается в переносе молекул исследуемого вещества с одного твердого носителя, исполь­зуемого для фракционирования биополимеров, на другой, где с помощью иммунохимической реакции происходит их специ­фическое выявление.

В зависимости от исследуемого вещества различают ДНК,— РНК и белок — блоттинг.

При постановке иммуноблоттинга соблюдается следующая методическая последовательность: электрофоретическое разделение анализируемого материала на индивидуальные белки или полипептиды в геле; получение реплики путем блоттинга белков или полипептидов с геля на твердофазный матрикс; блокирование фона, отмывка от компонентов, используемых при блокировании фона; инкубирование со спе­цифической тест-сывороткой; отмывка от избытка сыворотки; инкубирование с Jg к антителам специфической тест-сыворот­ки, конъюгированными с меткой; отмывка от избытка меченого иммунореагента; выявление тестируемых антигенов авторадиографически или ферментативно по реакции с соответствующим субстратом.

Иммунохимическое выявление антигенов можно прово­дить с помощью антител, конъюгированных с меткой. В ка­честве метки в последнее время широко применяют либо ра­диоактивные изотопы, либо ферменты (пероксидазу, щелоч­ную фосфатазу, лактамазу и др.).

Время блоттинга путем диффузии составляет 36—48 ч. Но наиболее быстрый и эффективный способ переноса белков с гелей — электроблот, время которого, в основном, составляет 1—3 ч (2), для некоторых высокомолекулярных белков— более 12 ч.

Конкретный выбор сорбентов для различных модификаций блотов (нитроцеллюлоза либо бумага, обработанная соответствующим образом), выбор условий блокирования и иммуно-химического выявления антигенов полностью зависит от анти­гена, его количества, метода иммуноанализа и целей исследо­вания.

Метод ИБ по целому ряду обстоятельств получил наиболь­шее распространение как метод, пригодный для использования в качестве теста подтверждения.

Безусловное достоинство метода — возможность тести­рования антител к слабо или вовсе нерастворимым антигенам и исключение стадии введения радиоактивной метки в анти­гены.

О чувствительности в случае ИБ судят по предельному коли­честву нанесенного на гель антигена, которое при фракциони­ровании белков удается выявить иммунохимически после пере­носа с геля на твердую фазу (нитроцеллюлозу). Общая чувствительность анализа зависит от целого ряда причин: условий фракционирования и иммобилизации антигена на твердом но­сителе, уровня фона, специфичности и аффинности антител. Важное значение имеет вид используемой метки и способ ее выявления.

Таким образом, метод иммуноблотинга позволяет иденти­фицировать зоны антигена на твердой фазе, не связывая весь белок с антителами специфической сыворотки. Иммуноблотинг и его модификации в основном используются для типирования бактериальных и вирусных антигенов и антител, особенно в случае недостаточной разрешающей способности обычных систем, а также при анализе иммуноглобулинов, нуклеиновых кислот или как тест подтверждения в сочетании с другими методами.