Получение лейкоцитарного альфа-интерферона

Здравоохранение материалы / Противовирусные препараты / Получение противовирусных лекарственных препаратов / Получение лейкоцитарного альфа-интерферона

Страница 1

Способность лейкоцитов человека продуцировать интерферон была показана вскоре после открытия системы интерферона Айзексом /Франция/.

Методика заключается в следующем.

Из периферической крови доноров выделяют лейкоцитарную массу и подвергают культивированию в суспензии. Используют среду №1, в которую добавляют 0,0015 ед/мл инсулина и 100-200 ед/мл нативного интерферона. К лейкоцитам в концентрации (5-10)*106клеток/мл в качестве индуктора добавляют вирус болезни Ньюкасла с инфекционным титром не ниже 108/мл ТЦД50 в культуре куриных фиброластов. Продуцированный интерферон отделяют от культуральной среды путем центрифугирования.

ПОЛУЧЕНИЕ БЕТА -ИНТЕРФЕРОНА

Еще в 60-е годы было показано, что интерферон, провоцируемый клетками амниона человека, а также кожно-мышечными фибробластами, по своим свойствам отличается от лекоцитарного интерферона. В настоящее время для получения бета-интерферона используют диплоидные клетки человека. Супериндукцию осуществляют различными воздействиями - дихлоро-1-бета-D-рибафуранозилбенэимидазолом, хлороквином, нейтральным красным, УФ~радиацией и др.

ПОЛУЧЕНИЕ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА

Гамма-интерферон является продуктом Т-лимфоцитов человека. За последнее десятилетие благодаря усиленному изучению иммунного ответа и свойств иммуннокомпетентных клеток значительно расширились представления о функциях Т-лифоцитов, а также о продуктах, выделяемых Т-лимфоцитами - лимфокинах, обладающих свойствами биорегуляторов.

Гамма-интерферон, или иммунный интерферон, также является одним из активных регуляторов иммунного ответа, так как обладает супрессорной активностью в отношении продукции антител, вызывает активацию естественных киллеров.

Гамма -интерферон продуцируют активированные Т-лимфоциты.

Для получения больших количеств гамма-интерферона из периферической крови выделяют Т-лимфоциты и обрабатывают митогеном или антилимфоцитарной сывороткой. Например, к культуре с концентрацией лимфоцитов (I-2)*105 в 1 мл прибавляют стафилококковый энтеротоксин в концентрации 0,02 мкг/мл.

Культуры инкубируют в среде с человеческим альбумином. Интерферон выделяют из культуральной среды. Возможно повторное стимулирование культуры и повторное продуцирование интерферона.

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ЛЕЙКОЦИТАРНЫЙ ИНТЕРФЕРОН

Характеристика готового продукта,

Человеческий лейкоцитарный интерферон является видоспецифическим гликопротеидом, синтезируемым донорскими лейкоцитами в ответ на воздействие интерфероногена.

Специфичность препарата определяется следующими признаками:

А) противовирусной активностью

. В разведении, соответствующем титру активности, препарат должен защищать культуру человеческих клеток от цитопатического действия индикаторного вируса, взятого в дозе 100 ТЦД50

Б) устойчивостью активности к действию нуклеаз-РНК-азы и ДНК-азы;

В) чувствительностью активности к действию трипсина - при концентрации фермента 300 мкг/мл в течение I часа при 37°С препарат полностью инактивируется;

Г) чувствительностью активности к действию специфической антисыворотки - антиинтерфероновая сыворотка в разведении, соответствующем титру должна снижать защитное действие интерферона, взятого я количестве 10 ед, в реакции нейтрализации.

Основные требования к препарату.

Препарат должен быть вирусологически стерильным, нетоксичным и безвредным.

В разведении, соответствующем титру активности, препарат должен защищать культуру человеческих клеток от цитопатического действия индикаторного вируса.

Сухой препарат - пористый порошок серовато-коричневого цвета, легко растворимый в 2 мл дистиллированной воды. Остаточная влажность не должна превышать 2%,

Раствор препарата должен иметь различные оттенки красного цвета и желтоватый оттенок.

ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

Кровь заготавливают на станциях переливания крови в соответствии с действующими инструкциями, в стерильные многокамерные мешки или флаконы, заполненные консервирующим раствором.

Пластикатные мешки центрифугируют 4 мин при 4°С и из них выжимают последовательно - плазму, а затем 40 мл верхнего слоя с поверхности клеточной фракции (эритромасса) или 40 мл верхнего слоя клеточной фракции (лейкомасса), которые используют в дальнейшем в качестве источника лейкоцитов для биосинтеза препарата.

Образец крови, плазмы, эритромассы или лейкомассы от каждого донора, должен контролироваться на отсутствие инфицирования сифилисом, гепатитом, СПИДом в соответствии с действующими инструкциями. При отрицательных результатах контроля эритромасса и лейкомасса могут использоваться для производства интерферона не позднее, чем спустя сутки после забора крови от донора. Хранение их допускается при температуре не выше 4°С.

Плазма или сыворотка донорской крови входят в состав культуральной смеси на всех стациях биосинтеза интерферона.

Культивирование и контроль проиизводственных штаммов вирусов, получение культур куриных и человеческих фибробластов.